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動物組織細(xì)胞基因組DNA提取實驗步驟
點擊次數(shù):306 更新時間:2024-08-05

  一、實驗原理
  
  真核生物的一切有核細(xì)胞(包括培養(yǎng)細(xì)胞)都能用來制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi),因此,制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離,又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì),再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì),得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
  
  蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中,SDS可破壞細(xì)胞膜、核膜,并使組織蛋白與DNA分離,EDTA則抑制細(xì)胞中Dnase的 活性;而蛋白酶K可將 蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分離出來。
  
  二、儀器及試劑
  
  1. 儀器:
  
  恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計(GeneQuant)、移液器、玻璃勻漿器、離心管(滅菌)、吸頭(滅菌)
  
  2. 試劑:
  
  (1)細(xì)胞裂解緩沖液:
  
  Tris (pH8.0) 100 mmol/L
  
  EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
  
  NaCL 20 mmol/L
  
  SDS 10%
  
  胰RNA酶 20ug/ml
  
  (2) 蛋白酶K: 稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中,?C20℃?zhèn)溆谩?br/>  
  (3)TE緩沖液(pH 8.0):高壓滅菌,室溫貯存。
  
  (4)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)
  
  (5)異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。
  
  三、操作步驟
  
  1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g(12.5px3),盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中,加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊,轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中,加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl,混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min,也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12~24h,間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12000 rpm離心5min,取上清液入另一離心管中。
  
  2.加2倍體積異丙醇,倒轉(zhuǎn)混勻后,可以看見絲狀物,用100ul 吸頭挑出,涼干,用200ul TE 重新溶解。(可進(jìn)行PCR反應(yīng)等,需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行)
  
  3.加等量的酚?氯仿?異戊醇振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。
  
  4.取上層溶液至另一管,加入等體積的氯仿?異戊醇,振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。
  
  5. 取上層溶液至另一管,加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇,混勻后室溫沉淀2min ,離心12000 rpm ,10min。
  
  6.小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉。
  
  7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次,離心12000 rpm , 5min。
  
  8.小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉,室溫干燥。
  
  9.加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?br/>  
  10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。
  
  四、常見問題
  
  1.選擇的實驗材料要新鮮,處理時間不易過長。
  
  2.在加入細(xì)胞裂解緩沖液前,細(xì)胞必須均勻分散,以減少DNA團(tuán)塊形成。
  
  3. 提取的DNA不易溶解:不純,含雜質(zhì)較多;加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥,也將使溶解變得很困難。
  
  4. 電泳檢測時DNA成涂布狀:操作不慎;污染核酸酶等。
  
  5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8;不純,含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下,應(yīng)加入SDS至終濃度為0.5%,并重復(fù)步驟2~8。
  
  6.酚/氯仿/異戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸取:含高濃度的DNA,可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。

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