1. 感染預(yù)實(shí)驗(yàn)
以 24 孔培養(yǎng)板為例,同時(shí)進(jìn)行目的細(xì)胞和工具細(xì)胞的感染預(yù)實(shí)驗(yàn)。工具細(xì)胞可選擇 293T(人胚腎上皮細(xì)胞)、H1299(人肺癌細(xì)胞)或其它細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)材料:培養(yǎng)基、24 孔培養(yǎng)板,移液槍?zhuān)瑯岊^, EP 管,細(xì)胞計(jì)數(shù)板、冰盒、廢液缸等。(根據(jù)目的細(xì)胞情況,可酌情使用 Polybrene)
Day1:
準(zhǔn)備細(xì)胞:培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞以胰yi酶消化計(jì)數(shù)后,用細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)出細(xì)胞密度,每孔接種 5×104 個(gè)細(xì)胞,添加細(xì)胞培養(yǎng)液至 500µL。通常情況下,該接種量的 H1299 或 293T 細(xì)胞在感染后第 3 天可生長(zhǎng)至 80%-90% 融合度。(接種目的細(xì)胞時(shí),請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞的實(shí)際生長(zhǎng)速度調(diào)整接種量,使目的細(xì)胞感染后第 3 天生長(zhǎng)至 80%-90% 融合度)
Day2:
(1)準(zhǔn)備慢病毒顆粒:計(jì)算所需慢病毒顆粒的量,將凍存在 -80℃ 的慢病毒顆粒取出,冰浴融化;
(2)感染目的細(xì)胞:從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞,置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞融合度;如細(xì)胞狀態(tài)較好,則開(kāi)始實(shí)驗(yàn):
A. 用移液槍小心吸去 24 孔板中的舊培養(yǎng)液,加入新的完wan全培養(yǎng)液;
B. 在細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的慢病毒顆粒液,將培養(yǎng)板平置于工作臺(tái)上,以劃 8 字的方式輕柔混勻;
C. 混勻后,細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱,過(guò)夜培養(yǎng)。
Day3:
更換培養(yǎng)液:感染 12-16 小時(shí)后,吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液,重新向培養(yǎng)板添加含 5% 滅活 FBS(胎牛血清)的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。(目的細(xì)胞需要調(diào)整感染時(shí)長(zhǎng),部分細(xì)胞不可感染超過(guò) 12 小時(shí)。)
Day4:
繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,觀察細(xì)胞狀態(tài)是否有異常。
Day5:
觀察(評(píng)估)慢病毒顆粒感染效率:蓋緊 24 孔培養(yǎng)板,使用 70% 乙醇清理培養(yǎng)板外壁,在倒置熒光顯微鏡觀察熒光,拍照并估計(jì)慢病毒顆粒對(duì)細(xì)胞的感染效率。(如果慢病毒顆粒攜帶的基因表達(dá)所需的時(shí)間較長(zhǎng),熒光表達(dá)所需時(shí)間也較長(zhǎng),建議感染 72、96 小時(shí)后觀測(cè)熒光表達(dá)。)
根據(jù)熒光情況,可以初步從 MOI 梯度摸索實(shí)驗(yàn)中,找出目的細(xì)胞的 MOI 值。