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大腸桿菌感受態細胞的制備經驗分享
點擊次數:351 更新時間:2024-03-19

細菌處于容易接受外源DNA的狀態稱之為感受態,通過物理或化學的方法,人工誘導細菌細胞成為敏感的感受態細胞是重組DNA轉化細菌技術的關鍵。制備出感受態細胞,我們就可以方便的將需要克隆的質粒導入其中,使其繁殖,從而獲得大量的質粒。CaCl2轉化法是常用的感受態細胞制備方法,其制備流程簡單,快捷,成本低,并且能夠滿足普通的轉化和克隆的需求。

判斷感受態細胞制備的優劣主要是通過轉化效率來檢測。經轉化外源質粒DNA的大腸桿菌在含抗性的LB平板過夜培養后,平板上長滿克隆且陰性對照(未轉入外源DNA的感受態)沒有克隆,證明感受態細胞制備良好。


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注意事項:

1、在制備感受態細胞過程中,所有用到的耗材,試劑均要求無菌,操作過程也要求wan全按照無菌操作進行,避免雜菌及污染。

2、制備感受態的菌株最好是先將甘油菌劃線于無抗性的LB平板中進行活化,然后挑選單克隆的液體培養基中培養。如果甘油菌溶解后直接在液體培養基中培養來制備感受態,會影響感受態細胞的活性。

3、在制備感受態細胞的過程中,保持各環節處于低溫環境,4℃離心,冰上重懸,CaCl2溶液置于冰浴中,以保證感受態細胞的轉化效率。

4、重懸細胞時,盡量避免吹打細胞造成細胞損傷,通過輕輕震蕩使細胞重懸,減少對菌株的損傷從而影響其活性。

5、制備好的感受態細胞應盡快使用,存放過久會影響其轉化效率。

6、感受態細胞不宜反復凍融,因為凍融過程中產生的冰晶會對細菌細胞造成傷害。


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