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皮質(zhì)醇ELISA試劑盒常見的定量方法
點擊次數(shù):1314 更新時間:2017-06-05

皮質(zhì)醇ELISA試劑盒常見的定量方法
測定原理:現(xiàn)在皮質(zhì)醇ELISA試劑盒除非是測定抗體的以外,一般使用的是雙抗體夾心法,此種方法大多數(shù)用的是增強的雙抗體夾心法,即使用生物素-親和素系統(tǒng),及少數(shù)的指標可能使用競爭法,這類方法適用于半抗原的測定。
具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多表位蛋白抗原,其雙抗體夾心法中的一個抗體必須用單抗,否則背景很高。當(dāng)然如果兩個都是單抗(這兩個單抗針對不同表位),那么測定的線性范圍就較寬,試劑盒性能就較好;一個用單抗,一個用多抗,測定的靈敏度會較高。
某些簡單的化合物用皮質(zhì)醇ELISA試劑盒測定時,因為沒有兩個或以上的表位,一般只能作為半抗原,只能用競爭法測定。如果你發(fā)現(xiàn)有測定簡單化合物(如雌激素、NO、)用雙抗體夾心法作測定原理時,這個試劑盒你就要懷疑了。另外還要說明一步雙抗體夾心法與兩步雙抗體夾心法的區(qū)別。
一步雙抗體夾心法的吸光度-劑量曲線呈鐘形,隨著待則標本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后,測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色,即所謂的“鉤狀效應(yīng)”(hookeHect),也就是我們在免疫沉淀試驗中所稱的“帶現(xiàn)象”(zonephenomenon)。所以當(dāng)使用一步雙抗體夾心法時,樣品濃度太高,有時會出現(xiàn)測不出來的現(xiàn)象,此時要作適當(dāng)?shù)南♂尣拍軠蚀_測定。
皮質(zhì)醇ELISA試劑盒的組成:用雙抗體夾心法作為測定的方法時,試劑盒的組成一般包括:已包被單抗的酶標板:一塊,有96孔的,也有48孔的,可拆缷,鋁箔袋密封,打開后有干燥劑,實驗時暫未使用的酶標條要連帶干燥劑密封好,放在4℃冰箱中妥善保存。
皮質(zhì)醇ELISA試劑盒操作步驟
1、準備:從冰箱取出試劑盒,室溫復(fù)溫平衡30分鐘。
2、配液:用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3、加標準品和待測樣本:取足夠數(shù)量的酶標包被板,固定于框架上,分別設(shè)置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔,記錄各孔位置,在標準品孔中加入標準品50μL;待測樣本孔中先加入待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL(即樣本稀釋5倍);空白對照孔不加。
4、溫育:37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5、洗板:棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)。
6、加酶標工作液:每孔加入酶標工作液50μL,空白對照孔不加。
7、溫育:重復(fù)4的操作。
8、洗板:重復(fù)5的操作。
9、顯色:每孔先加入顯色劑A 液50μL,再加入顯色劑B液 50μL,37℃避光顯色15min。
10、終止:取出酶標板,每孔加終止液50μL,終止反應(yīng)(顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色)。
11、測定:以空白孔調(diào)零,在終止后15分鐘內(nèi),用450nm波長測量各孔的吸光值(OD值)。
12、計算:根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的OD值,計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣本的OD值,在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度,也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。

 

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